Introducción
La periodontitis es una enfermedad infecciosa de características inflamatorias, la cual se caracteriza por la destrucción de los tejidos de soporte del diente: cemento radicular, ligamento periodontal y hueso alveolar (1). Es reconocida la etiología multifactorial de la periodontitis, donde factores genéticos y ambientales interactúan para producir la enfermedad y modificar su expresión clínica (2). Los estudios epidemiológicos indican que el riesgo para desarrollar periodontitis no es igual para todos los individuos (3). Las bacterias y otros factores ambientales inician y modulan la enfermedad periodontal, se sabe que cada individuo responde de forma diferente a los retos comunes del entorno, y que esta respuesta diferencial está influida por el perfil genético del individuo (4).
Los genes desempeñan un papel en la predisposición y en la progresión de las enfermedades periodontales (5). La variación genética es un determinante principal del riesgo diferencial para muchas enfermedades humanas (6).
La periodontitis agresiva es un tipo específico de periodontitis con características clínicas identificables claramente. Dentro de las características comunes de las periodontitis agresivas se encuentran que el individuo es desde un punto de vista sistémico sano, con presencia de una rápida pérdida de inserción y destrucción ósea alveolar y agregación familiar (7).
La agregación familiar de un rasgo o una enfermedad puede sugerir una etiología genética. Sin embargo, las familias también comparten muchos aspectos de un entorno común, incluyendo la dieta, las exposiciones a contaminantes y comportamientos como el consumo del tabaco, además, ciertos agentes infecciosos pueden agruparse en familias. Así, la agregación familiar puede deberse a los genes compartidos, a la exposición a un ambiente también compartido o a similares influencias socioeconómicas. Diversos reportes de agregación familiar han sugerido un componente genético para la periodontitis agresiva (4). Marazita y colaboradores (8) detectaron un patrón de transmisión autosómica dominante para la periodontitis de inicio precoz.
Por otro lado, la periodontitis crónica es la forma mas común de periodontitis que afecta a los adultos y se caracteriza por una taza de progresión de leve a moderada, aunque puede tener períodos de rápida progresión (9). Los genes han sido implicados en participar en la periodontitis crónica, pero a diferencia de la periodontitis agresiva, esta no sigue un patrón simple de transmisión familiar o de distribución.
En las enfermedades complejas, las variantes genéticas en múltiples loci genéticos contribuyen a la predisposición global a la enfermedad. Por lo que no es posible una simple relación causa-efecto entre un alelo genético particular y una enfermedad (10). Los polimorfismos genéticos historicamente han sido utilizados como marcadores genéticos para localizar genes causantes de la enfermedad mediante estudios de linkage (11-13). Sin embargo, también se ha podido comprender que los polimorfismos pueden influir sobre complejas enfermedades comunes vía efecto directo sobre la función del gen (14).
Los genes para FCYR están asociados con riesgo par varios tipos de periodontitis como la periodontitis agresiva, periodontitis crónica y periodontitis crónica recurrente (10-15). Fu Y y colaboradores (16) mostrarón una mayor prevalencia para el genotipo FCYRIIIB-NA2 en el grupo con periodontitis juvenil localizada que en el grupo control sano (p= 0,024) y concluyen que este tipo de polimorfismo podría representar un marcador de riesgo para susceptibilidad a periodontitis juvenil localizada en la población afromericana. Por otro parte, Yakamoto y colaboradores (17) observaron que los sujetos con un genotipo FCYRIIA-H131 presentaban una mayor producción de IL-1β cuando se comparan con sujetos con el genotipo FCYRIIA-R131 (p<0,05), lo que apoya el concepto de que el polimorfismo FCYRIIA-H131 puede afectar la producción de IL-1β, conduciendo a diferencias interindividuales en el riesgo para periodontitis. En otro estudio se mostró que el polimorfismo FCYRIIA-H131 puede estar asociado con riesgo de periodontitis crónica y con severidad de la enfermedad en fumadores caucásicos (18).
Actualmente es reconocida la etiología multifactorial de la periodontitis, donde factores genéticos y ambientales interactúan para producir la enfermedad y modificar su expresión clínica. De esta forma el objetivo de este estudio fue determinar la asociación entre la presencia del polimorfismo para el receptor de IgG subclase III A (FCYRIIIA-158V-F) y la periodontitis severa.
Materiales y Métodos
Selección de los pacientes
Se estudiaron 150 pacientes, seleccionados en la Clínica de Periodoncia de la Universidad Nacional Andrés Bello. Todos los participantes fueron clínicamente evaluados, diagnosticados y clasificados en tres grupos de la siguientes manera: 32 pacientes con periodontitis agresiva, 71 pacientes con periodontitis crónica, y 47 voluntarios clínicamente sanos sin periodontitis.
Los sujetos completaron los cuestionarios de historia médica y dental personal y familiar y fue requerido que tuvieran padres y abuelos chilenos, con el fin de reducir la heterogenicidad genética en los cohortes.
La selección de los pacientes se basó en los grados de destrucción de los tejidos periodontales, evaluados por los parámetros clínicos de profundidad de sondaje, pérdida de inserción clínica, grado de movilidad dental y evidencia radiográfica de pérdida de hueso alveolar.
Todos los sujetos recibieron una clara explicación del protocolo de investigación y firmaron un consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional Andrés Bello.
Obtención de muestras, extracción de ADN y determinación de genotipos
Las muestras consistieron en muestras de sangre periférica, aproximadamente 20µl, obtenidas a partir del dedo medio de la mano menos utilizada por el individuo. La sangre se depositó en microtarjetas FTAelute (Merck) y estas fueron almacenadas en un lugar seco con sílica gel.
La extracción de ADN se llevó a cabo desde las microtarjetas FTAelute según las indicaciones del fabricante. La extracción consistió en cortar círculos de 3 mm de diámetro, traspasar a un tubo Eppendorf y agregar 500 uL de agua mili Q estéril, con posterior agitación en vórtex, centrifugación a máxima velocidad, retirar y descartar el sobrenadante, recuperar los círculos secos (centrifugar nuevamente si es necesario) para traspasarlos a un tubo Eppendorf nuevo y agregar 50 uL de agua mili Q estéril. Posteriormente se somete a un ciclo termal de 95 ºC por 30 min y centrifugación por 1 min a máxima velocidad para recuperar todo el volumen, eliminando los círculos.
Los polimorfismos seleccionados fueron amplificados por PCR, para lo cual se diseñaron partidores específicos de acuerdo a los programas dCAPS Finder 2.0 y Primer3. El diseño de los partidores contempló en la totalidad de los casos la inclusión de un sitio restricción.
Para un volumen de reacción final de 25 μL, se agregará en un tubo Eppendorf de 0,6 μL 2,5 μL de Buffer de PCR 10X, 1 μL de cloruro de magnesio 50 mM, 4μL de mix de dNTPs 200 uM, 0,375 μL de cada uno de los partidores (Forward: 5´GGAAGTATTTTCATCATAATTCTGACTTG3´; Reverse: 5´AACTCAACTTCCCAGTGTGATTGCAG 3´) para una concentración final de 0,3 uM, 0,2 μL de DNA Taq polimerasa 5 U/μL, 2,5μL de BSA 10 μg/μL, 2 μL de ADN (según lo indicado por el fabricante de microtarjetas FTAelute Merck) y luego con agua mili Q estéril se completó el volumen final de reacción. El programa consiste en un ciclo de desnaturación de 3 min a 94 ºC, posteriormente 30 ciclos que comprendían 50 s a 94 ºC, 30 s a 50,5 ºC y 1 min a 72 ºC, finalmente un ciclo de extensión final de 10 min a 72 ºC.
Tras las amplificaciones se llevó a cabo un corte con enzimas de restricción (Rsal) para todos los casos, las digestiones se realizaron en un volumen final de 20μL, que consiste en 10 μL del producto de PCR, 5 μL de la enzima de restricción, 2 μL del buffer correspondiente en cada caso y se completa el volumen final con agua mili Q estéril.
Análisis estadístico
Se realizó un análisis multivariable utilizando el programa estadístico STATA, para evaluar el efecto de variables múltiples como sexo, edad, y hábito de fumar en el total de muestras. A continuación se determinó el Equilibrio de Hardy-Weinberg en las frecuencias alélicas y genotípicas para el número total de muestras y para cada grupo utilizando los programas Hardy-Weinberg equilibrium.
Finalmente se determinó la asociación variable-fenotipo. Para esto se seleccionó el Test de Chi cuadrado y Test de Fisher para realizar una comparación de las distribuciones de las frecuencias alélicas y genotípicas entre las tres poblaciones de sujetos seleccionados (sanos,periodontitis crónica y periodontitis agresiva). Para determinar la fuerza de las asociaciones se estimó la razón de disparidad Odds Ratio (OR) con un intervalo de confianza (CI) de 95%.
Resultados
Se seleccionaron muestras de sangre periférica de 150 pacientes, de las cuales 47 correspondieron a individuos clínicamente sanos, 71 a pacientes con periodontitis crónica y 32 con periodontitis agresiva. Las características clínicas de los sujetos estudiados se muestran en la Tabla 1.
Un análisis de multivariable mostró que las variables sexo y hábito de fumar no se relacionaron significativamente con ninguno de los grupos en estudio (p > 0,05). Sin embargo, la variable edad se asoció significativamente (p<0.0001; Test Chi cuadrado, CI 95%), al grupo de estudio con periodontitis crónica. Las frecuencias genotípicas de los tres grupos evaluados cumplieron con el equilibrio Hardy-Weinberg (Test Chi cuadrado, valor-p >0.05, IC 95 %).
Frecuencias alÉlicas
Las frecuencias alélicas para el polimorfismo del FCYRIIIA-158V-F en las tres poblaciones en estudio se muestran en la Tabla 2 y Figura 1.
Al evaluar la distribución de las frecuencias alélicas en los tres grupos, se determinó una asociación estadísticamente significativa entre el grupo de pacientes con periodontitis agresiva y la presencia del alelo T (p≤0,004), con un Odds ratio (OR) de 4,5 (IC 95%), la sensibilidad correspondió al 94% y la especificidad al 23%, con un valor predictivo positivo del 45% y un valor predictivo negativo del 85%.
Al comparar el grupo de pacientes crónicos con el grupo de individuos sanos, se encontró también una diferencia estadísticamente significativa para la presencia del alelo T (p≤0,01), con un OR de 4,03 (IC 95%), la sensibilidad correspondió al 93% y la especificidad al 23%, con un valor predictivo positivo de 64% y un valor predictivo negativo del 68%.
La diferencia entre la condición de enfermo (periodontitis crónica y agresiva) y el grupo de individuos sanos fue estadísticamente significativa para la presencia del alelo T (p≤0,004), con un OR de 4,03 (IC 95%), la sensibilidad correspondió al 93% y la especificidad al 23%, con un valor predictivo positivo del 72% y un valor predictivo negativo del 61%.
Frecuencias genotipicas
Las frecuencias genotípicas del polimorfismo del FCYRIIIA-158V-F en las tres poblaciones de estudio se indican en la Tabla 3 y Figura 2.
Al evaluar la distribución de las frecuencias genotípicas en los tres grupos se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de pacientes con periodontitis agresiva y la presencia del genotipo homocigoto TT ((p≤0,001), un OR de 4,99 (IC 95%), la sensibilidad correspondió al 65% y la especificidad fue del 72%, con un valor predictivo positivo de 62% y un valor predictivo negativo del 76%.
La condición de enfermo (periodontitis crónica y agresiva) fue estadísticamente significativa para la presencia del genotipo homocigoto TT (p≤0,04), con un OR de 2,11 (IC 95%), la sensibilidad correspondió al 45% y la especificidad al 72%, con un valor predictivo positivo de 78% y un valor predictivo negativo de 37%.
En el grupo de individuos sanos se observó una asociación estadísticamente significativa con la presencia del genotipo homocigoto CC cuando se compara:
- Con el grupo de pacientes con periodontitis agresiva (p≤0,044), con un OR de 0,218 (IC 95%), donde la sensibilidad correspondió al 6% y la especificidad al 77%, con un valor predictivo positivo del 15% y un valor predictivo negativo del 55%.
- Con el grupo de pacientes con periodontitis crónica (p≤0,011) con un OR de 0,248 (IC 95%), la sensibilidad correspondió al 7% y la especificidad al 77%, con un valor predictivo positivo del 31% y un valor predictivo negativo del 35%.
- Con la condición de enfermo (p≤0,044), con un OR de 0,239 (IC 95%), la sensibilidad correspondió al 7% y la especificidad al 77%, con un valor predictivo positivo del 38% y un valor predictivo negativo del 27%.
Discusión
El receptor para la fracción constante de la IgG (FCYR) une las ramas celular y humoral del sistema inmune, lo que es considerado esencial para la defensa del hospedero contra las bacterias. (10). Diferentes estudios han asociado los polimorfismos de dicho receptor con la periodontitis (18,19, 20, 21, 22).
El presente estudio investigó si existía alguna asociación entre la presencia del polimorfismo FCYRIIIA-158V-F y la periodontitis severa en una población de pacientes chilenos. Este gen candidato cumple con el Equilibrio de Hardy- Weinberg.
Chung y colaboradores (21) mostraron que el polimorfismo para el FCYRIIA-R131 fue encontrado más frecuentemente en el grupo con periodontitis agresiva que en el grupo control sano. Igualmente Loos y colaboradores (22) encontraron que los pacientes con periodontitis agresiva presentaban una mayor frecuencia de los polimorfismos para FCYRIIA-H131 y FCYRIIIA-158V cuando se comparaban con controles sanos.
Sugita y colaboradores (23) observaron que los sujetos con periodontitis recurrente presentaban una mayor frecuencia del polimorfismo FCYRIIIA-158F en comparación con aquellos sujetos sin recurrencia de la enfermedad, postulando al FCYRIIIA como un gen candidato para el riesgo de recurrencia de la periodontitis del adulto. Sugieren también que los bajos niveles de IgG1 e IgG3 que une a las células NK, macrófagos y linfocitos en sujetos portadores del FCYRIIIA-158F, podría ser el mecanismo responsable de la disminución en la función de estas células de estos individuos.
Nuestros resultados concuerdan con los obtenidos por Sugita y colaboradores (23) en una población japonesa, donde se determino que el polimorfismo FCYRIIIA-158F estaba asociado significativamente con la periodontitis crónica. Por otro lado Meisel y colaboradores (19) encontraron una asociación estadísticamente significativa para la presencia del FCYRIIIA-158V en la periodontitis crónica severa, este estudio también encontró una asociación significativa para el grupo con periodontitis crónica, pero esta asociación se dio solamente con el alelo FCYRIIIA-158F.
En nuestro estudio encontramos una asociación significativa con la periodontitis agresiva, sin embargo esta frecuencia significativamente mayor correspondió al alelo T (FCYRIIIA-158F), del gen polimórfico FCYRIIIA-158V-F. El alelo C (FCYRIIIA-158V), se mostró en nuestro estudio como un factor protector.
En nuestra investigación el alelo T aparece firmemente asociado a la periodontitis severa, la fuerza de esta asociación determina que el riesgo de desarrollar periodontitis agresiva es 4,5 veces mayor cuando se es portador del alelo T y la probabilidad de desarrollar periodontitis crónica es 4 veces mayor cuando se porta el alelo T.
También encontramos una asociación estadísticamente significativa entre la presencia del genotipo homocigoto TT para el gen FCYRIIIA-158V-F y la presencia de periodontitis agresiva. Al comparar la condición de enfermo (individuos con periodontitis crónica y agresiva) con el grupo de individuos sanos también observamos una mayor prevalencia del genotipo TT en los sujetos con la condición de enfermo. Estos resultados podrían indicar que los sujetos con un genotipo homocigoto TT para el gen FCYRIIIA-158V-F tendrían una mayor susceptibilidad o un riesgo de 4,9 veces mayor para desarrollar periodontitis agresiva y un riesgo de 2,11 veces para desarrollar periodontitis severa.
La presencia del genotipo homocigoto CC para el gen polimórfico FCYRIIIA-158V-F se encontró con una mayor prevalencia en el grupo de sujetos sanos que en el grupo de periodontitis agresiva y en el grupo de periodontitis crónica, por lo que se podría pensar en un posible rol protector para la presencia de ese genotipo.
Wang y colaboradores (24) consideran que el valor de la asociación estadística usando X2 en poblaciones pequeñas se incrementa notoriamente si se considera el valor del OR. Si el OR es mayor de 1.3, el poder estadístico de la fuerza de asociación obtenida valida los resultados obtenidos, mientras que si el OR es menor de 1.3, se necesitara muestras poblacionales de mayores de 100000 sujetos de tamaño). Aunque nuestra población de estudio es relativamente pequeña, la fuerza de la asociación obtenida es muy alta, los OR van de 2 a 4.9, lo que permite validar de alguna manera nuestros resultados.
Conclusiones
El presente estudio sugiere una asociación estadísticamente significativa entre la presencia del alelo T en el gen polimórfico del receptor FCYRIIIA-158V-F y la condición de enfermo periodontal severo, de tal manera que el ser portador del alelo T determina una mayor probabilidad de desarrollar periodontitis severa. La presencia del alelo T en el gen candidato del receptor FCYRIIIA-158V-F indica una mayor probabilidad de desarrollar periodontitis agresiva y crónica. La presencia del alelo T y el genotipo TT en FCYRIIIA-158V-F podrían considerarse como marcadores de susceptibilidad de periodontitis severa. Debido a la importancia de identificar sujetos suceptibles a la periodontitis recomendamos realizar más estudios.
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